繼上回的準(zhǔn)備篇和菌種篇，這回要真正測(cè)定了。在各個(gè)測(cè)定管孵育20小時(shí)以上獲得zui大濁度時(shí)，即可用渦旋振蕩器混勻，之后倒入1cm比色杯，在540nm處測(cè)定吸光度（OD值）。以未接種的對(duì)照管的OD值為0，依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管、樣本。如果對(duì)照管OD值＞0.1，或者標(biāo)準(zhǔn)管OD值變化＜40%，說(shuō)明有雜菌或葉酸混入，需重做。

測(cè)完OD值后，以葉酸含量為橫坐標(biāo)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管OD均值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣本OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定樣品對(duì)應(yīng)的葉酸含量。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，有人發(fā)現(xiàn)OD值隨著葉酸濃度增加而增長(zhǎng)趨緩, 略呈S形。若使用線性方法，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布在曲線兩側(cè)，求得的葉酸濃度不準(zhǔn)。建議使用EXCEL功能建立4階曲線方程，則曲線與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合程度較好（1）。

圖1. 1階線性擬合

圖2. 4階線性擬合，優(yōu)于1階

采用直接提取法進(jìn)行的葉酸含量可按如下公式進(jìn)行計(jì)算。其前提是：每個(gè)樣品有2個(gè)管葉酸含量在0.10ng-0.80ng范圍內(nèi)，且各管間偏差小于10%。

計(jì)算公式：

葉酸含量（g/100g）= (C*V*f)/m * 0.1

C為樣品稀釋液葉酸濃度(ng/ml)，V為提取液定容體積（ml），f為樣本提取液稀釋倍數(shù)，m為樣本質(zhì)量（g），0.1為ng/g換算為g/100g的系數(shù)。

以上就是相對(duì)完整的測(cè)定過(guò)程，不僅適合嬰兒配方食品，也適合谷薯、果蔬、豆及堅(jiān)果類(lèi)食品，只不過(guò)樣品需要用酶解提取法。大致過(guò)程如下：準(zhǔn)確稱(chēng)量適量試樣（0.2-2g葉酸），如堅(jiān)果類(lèi)是0.2-2g，至0.0001g，轉(zhuǎn)入100ml錐形瓶中，加30mlPBS（含抗壞血酸作為葉酸保護(hù)劑），混勻5分鐘后高壓滅菌。再加1ml雞胰腺溶液。對(duì)于蛋白和淀粉含量豐富的樣本，應(yīng)再加1ml蛋白酶和淀粉酶溶液。再加3至5滴甲苯后，37℃孵育16小時(shí)，再轉(zhuǎn)入100ml容量瓶，加水定容，過(guò)濾。

之所以采取酶解法，是因?yàn)樵谝恍┦称分腥~酸以蛋白結(jié)合的形式存在，以上提取方法是依據(jù)中國(guó)預(yù)防科學(xué)院食品與衛(wèi)生研究所對(duì)食品前提取方法進(jìn)行的研究(2)。該研究還發(fā)現(xiàn)，蔬菜樣品采用二次水解法效果比較好；葉酸在酸性和過(guò)堿性環(huán)境中破壞嚴(yán)重，因此樣品提取液和培養(yǎng)基pH值應(yīng)控制在6.8-7.2。

世界微生物培養(yǎng)基生產(chǎn)商HiMedia提供全系列進(jìn)口維生素測(cè)定用培養(yǎng)基，其中葉酸干酪培養(yǎng)基（貨號(hào)M543），維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基（貨號(hào)M036），質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，成分*符合我國(guó)相關(guān)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)到貨期4-6周，加急訂單2-3周。詳情可詳詢國(guó)內(nèi)總代理北京締一生物：。

參考文獻(xiàn)

1. 唐靚，等.國(guó)標(biāo)<食品中葉酸的測(cè)定>的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與計(jì)算.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志. 2009,19(7):

2.王竹. 樣品前處理對(duì)食物中葉酸測(cè)定的影響.衛(wèi)生研究. 2000, 29 (6):404-406