隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，核酸編輯、擴(kuò)增、測(cè)序、鑒定等以核酸為中心的技術(shù)變得越來(lái)越先進(jìn)和方便，尤其是單細(xì)胞RNA測(cè)序、數(shù)字PCR和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，使得核酸技術(shù)應(yīng)用越來(lái)越廣泛，靈敏度也越來(lái)越高。

但同時(shí)也產(chǎn)生一些弊端，主要是：

1）PCR實(shí)驗(yàn)造成DNA大量合成，不可避免地給實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)核酸污染。由于核酸產(chǎn)物不能自動(dòng)降解，因此只會(huì)不斷積聚；

2）由于靈敏度升高，少量污染的DNA或RNA分子也會(huì)被檢測(cè)出來(lái)，從而造成實(shí)驗(yàn)偏差。

3）核酸污染也給實(shí)驗(yàn)人員帶來(lái)未知的健康風(fēng)險(xiǎn)。

而傳統(tǒng)的紫外照射法對(duì)祛除DNA污染并不理想，因?yàn)樗鼉H對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。

那么，有沒有一種更好的方法呢？

Mynox® Gold 殺滅支原體 步驟詳解

 

Mynox® Gold含惟一的支原體殺除劑（而非抑制劑）Mynox®以及復(fù)合抗生素，用于祛除污染珍貴細(xì)胞或病毒種子批中的支原體和保種用。一個(gè)療程它由1管*治療液和3管主治療液，每管均為520μl即用型無(wú)菌溶液，2℃~8℃避光保存。*治療液可以殺滅大部分支原體，對(duì)細(xì)胞沒有毒害，主治療液殺滅所有剩余的支原體，實(shí)現(xiàn)**。

其操作示意圖如下：

 

實(shí)驗(yàn)所需耗材：25cm2
細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60 mm 培養(yǎng)皿

支原體消除結(jié)果評(píng)估：采用支原體檢測(cè)試劑盒如Venor® GeM系列。

具體操作步驟如下（超凈臺(tái)內(nèi)操作）：

1. 制備“*治療混合液”

1）吸量管吸取4.5ml含5%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，加入到無(wú)菌的15ml離心管中。再加入500 µl Mynox ® Gold*治療液（橘黃色蓋）。

2）將15ml離心管內(nèi)的培養(yǎng)基和Mynox® Gold*治療液混勻。

3）將15ml離心管內(nèi)的混合液（5ml）轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60 mm 培養(yǎng)皿中。

2. 加入細(xì)胞

按細(xì)胞正常傳代來(lái)操作。對(duì)于貼壁細(xì)胞，使用胰酶將細(xì)胞解離打散。

1）注意：顯微鏡下觀察，確保為單細(xì)胞懸液，無(wú)細(xì)胞成團(tuán)。

2）吸量管吸取5ml單細(xì)胞懸液（含104–105細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基含5%胎牛血清），加入到上述的“*治療混合液”中。此時(shí)總體積為10ml。

注意：加入細(xì)胞時(shí)，吸頭插入到液面下，以避免產(chǎn)生氣溶膠。吸頭不要觸及培養(yǎng)瓶/皿的內(nèi)壁。

3）輕輕搖晃培養(yǎng)瓶/皿，以避免細(xì)胞分布不均。將細(xì)胞轉(zhuǎn)至孵箱正常培養(yǎng)。

3. 主要治療

1）細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合。

2）細(xì)胞正常傳代。取9.5ml已加新鮮培養(yǎng)基的細(xì)胞，加到無(wú)菌培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。再加入500 µl Mynox® Gold主治療液（透明管蓋）。調(diào)整胎牛血清濃度，不再將其濃度保持在5%，可恢復(fù)正常濃度。

3）加入主治療液的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，再重復(fù)以上步驟2次（采用Mynox® Gold主治療液 治療2次）。

第3次主治療液治療后，支原體即*去除（細(xì)胞總共傳了4代）

4. 支原體殘留的檢測(cè)

注意：支原體被Mynox®裂解后會(huì)釋放DNA到培養(yǎng)基中，此時(shí)檢測(cè)支原體會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。應(yīng)再正常培養(yǎng)四代后檢測(cè)支原體。培養(yǎng)基更換和使用外源DNA酶可在1-2代內(nèi)降低游離的支原體DNA。

建議采用高靈敏度的Venor ® GeM支原體檢測(cè)試劑盒檢查支原體。