細(xì)胞培養(yǎng)中的

支原體檢測

生物制品和細(xì)胞治療企業(yè)已越來越多地采用核酸法進(jìn)行支原體的檢查和生產(chǎn)質(zhì)控。核酸法如替代傳統(tǒng)藥典方法，則需進(jìn)行方法驗證。

Minerva Biolabs

支原體檢測標(biāo)準(zhǔn)品

德國MB公司出品有一系列常見支原體或支原體基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)品，包括靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品（10CFU,100CFU）、特異性標(biāo)準(zhǔn)品以及PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品，其中靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品也可用于耐用性的驗證。

MB廠家具有ISO 9001和ISO 13485質(zhì)量體系認(rèn)證。每個批次支原體標(biāo)準(zhǔn)品都有驗證和質(zhì)控。同時支原體培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基每個批次都符合歐洲藥品質(zhì)量管理局（EDQM）的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)品每個批次都提供有質(zhì)控證書（COA）。標(biāo)準(zhǔn)品所用的支原體菌株來自英國NCTC菌種保藏中心，同時具有相應(yīng)的ATCC編號。

MB共有以下三類標(biāo)準(zhǔn)品，在質(zhì)控方面都做到高標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)要求。

一、支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品

二、支原體特異性標(biāo)準(zhǔn)品

三、PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品

一

支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品

10CFU/100CFU支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品為滅活支原體，用于核酸法的靈敏度和耐用性驗證。靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品主要在功能檢測方面的進(jìn)行質(zhì)控：

功能檢測：

即標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后作DNA抽提（采用MB公司的Venor®GeM Sample Preparation Kit），再用符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的qPCR試劑盒檢測，應(yīng)保證有擴增曲線。

二

支原體特異性標(biāo)準(zhǔn)品

該基因組DNA是從相應(yīng)的支原體中抽提出來，并制成凍干粉。每管為10ng左右，用于支原體特異性驗證實驗。

復(fù)溶時，每管加配套的Tris緩沖液，室溫靜置5分鐘，再渦旋離心5秒鐘。

廠家對基因組中的16S rRNA片段進(jìn)行了序列分析，要求應(yīng)與相應(yīng)支原體物種的同源性應(yīng)達(dá)到99%以上。對制備的DNA質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行了熒光分析和PCR擴增。PCR擴增應(yīng)顯示為單一的擴增條帶。

三

PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品

每管為1x10^8拷貝的支原體物種基因組DNA凍干粉，使用時也是先用廠家提供的Tris緩沖液復(fù)溶。

質(zhì)控時，對16S rRNA的部分序列進(jìn)行測序分析，以鑒定支原體物種，測序結(jié)果應(yīng)顯示為99%以上的同源性。再對該標(biāo)準(zhǔn)品作系列梯度稀釋，再進(jìn)行qPCR擴增，應(yīng)顯示為良好的線性。該方法還可確定qPCR方法的檢測閾值。

總結(jié)

MB公司的上述三類標(biāo)準(zhǔn)品可用于對支原體核酸法的方法學(xué)驗證，包括靈敏度、特異性和耐用性。其中，基因組DNA除了包括常見支原體物種外，還包括一些常見細(xì)菌，用于驗證常規(guī)PCR或qPCR的檢測是否會產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

總之，良好的質(zhì)控是標(biāo)準(zhǔn)品品質(zhì)的保證，這樣才能確保方法驗證結(jié)果的可靠性，使支原體的核酸法檢測符合藥典所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，從而為替代培養(yǎng)法等經(jīng)典支原體的檢測方法提供數(shù)據(jù)支持。