支原體污染確實是細胞培養(yǎng)中一個非常頭疼的問題，因為它通常沒有明顯的外觀變化，但會嚴重影響細胞的各項生理功能，導致實驗結果不準。

預防支原體污染的專業(yè)建議

預防遠比處理更重要，核心在于建立一套嚴格的無菌操作規(guī)范和環(huán)境監(jiān)控體系。

1.源頭控制：

- 從信譽良好的機構購買經(jīng)過支原體檢測認證的細胞系。

- 新引入的細胞必須隔離培養(yǎng)，并進行支原體檢測，確認陰性后才能與其他細胞共用。

- 定期對工作細胞庫進行支原體篩查。

2.操作規(guī)范：

- 在超凈工作臺內進行所有操作，確保臺面無菌。

- 嚴格執(zhí)行個人防護，如佩戴一次性手套和口罩。

- 定期清潔和消毒培養(yǎng)箱、液氮罐、移液器等設備。

- 避免不同細胞系的交叉使用，如更換吸頭和培養(yǎng)基。

3.試劑管理：

- 使用無菌的培養(yǎng)基、血清和添加劑。

- 定期檢查試劑是否有渾濁、變色等異常。

常用的支原體檢測與清除試劑

1.檢測試劑：

- PCR檢測試劑盒：這是目前常用、靈敏的方法，能快速準確地檢測出支原體DNA。

- 熒光染色法：利用DAPI等染料使支原體DNA著色，在熒光顯微鏡下可觀察到。

2.清除試劑：

- 抗生素類：如支原體去除試劑（Mycoplasma Removal Agent, MRA），通常含有特定抗生素組合，能有效殺滅支原體。

- 抗支原體血清：通過免疫動物獲得，可特異性中和并清除支原體。

- 其他化學試劑：如某些消毒劑可用于環(huán)境和設備的消毒，但不能直接用于細胞培養(yǎng)體系。

為了方便你在實際操作中對照檢查，這里幫您整理了一份細胞培養(yǎng)支原體污染防控清單，這樣能幫你把這些要點落實到日常工作中。

細胞培養(yǎng)支原體污染防控清單

一、源頭控制與細胞管理

- 新細胞引入：新購買或饋贈的細胞，必須先在隔離培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

- 入庫檢測：所有細胞在建立工作細胞庫前，必須進行支原體檢測。

- 定期篩查：每3-6個月，對所有正在培養(yǎng)的細胞系進行一次支原體檢測。

二、無菌操作規(guī)范

- 個人防護：實驗開始前，更換干凈的實驗服，佩戴一次性手套和口罩。

- 臺面準備：用75%乙醇擦拭超凈工作臺面、移液器和將要使用的試劑瓶外壁。

- 避免交叉：不同細胞系操作時，更換吸頭、移液管和廢液缸，避免交叉污染。

- 及時清理：實驗結束后，立即清理臺面，用75%乙醇再次消毒。

三、試劑與耗材管理

- 無菌驗證：只使用有明確無菌證明的培養(yǎng)基、血清和添加劑。

- 避免污染：試劑分裝時，使用無菌操作，避免反復凍融和長時間室溫放置。

- 定期檢查：檢查培養(yǎng)基是否渾濁、變色，血清是否有沉淀或異常。

四、環(huán)境與設備維護

- 培養(yǎng)箱清潔：每周用75%乙醇擦拭培養(yǎng)箱內壁和隔板，定期更換水盤。

- 超凈臺維護：定期清潔和更換超凈臺的HEPA過濾器。

- 儀器消毒：液氮罐、離心機等設備，按規(guī)定進行定期清潔和消毒。

五、污染應急處理

- 隔離與確認：一旦懷疑污染，立即將可疑細胞隔離，并進行支原體檢測。

- 環(huán)境消毒：如確認污染，需對培養(yǎng)箱、超凈臺等進行消毒。

- 細胞處理：輕度污染可嘗試使用支原體清除試劑；嚴重污染建議丟棄，避免擴散。